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发瞛i眏ian:2020/07/24 点击量:

组zhi样品中RNAde提取shi验:本shi验de组zhi样品zhu要有小鼠de各ge组zhi器官(如肝zang,肌肉,zhi肪等)和人zhong瘤biao本(如结zhi肠癌,肺癌,乳腺癌)
 


  1.首先要genju需要抽提de组zhi样品de质量加入相应deTRIZOL液体,同时加入ruo干ke不xiu钢zhu。本shi验室一般情况如xia:(小鼠组zhi加入TRIZOL,结zhi肠癌biao本加入TRIZOL)

  注yi:

  a.用wu松娱le匀jiang机进行匀jiangchu理时样品体积最好不要超过TRIzol体积10℅)

  b.需事先yu冷试管座

  2.把加入样品,TRIZOL,不xiu钢zhudeAxygene EP管放入事先yu冷好de试管座中。机器设置好参shu盖蓌i亲樱慊髟诵宵br style="margin: 0px; padding: 0px;" />
  3.机器运行完毕后,打开盖子,拿出wu松娱leEP管仔xi观cha组zhide研磨情况,如果胔ui忻飨詃ekuai状物,那jiu可yi进入xia一步shi验步骤,如果胔ui型耆蛩椋剐枰袳P管放入试管座中,继续匀jiang。有些jian觔o蛘遺hi肪含量高de组zhi(乳腺)可neng需要稍wei长一点de时jian,时jian可yi依ju组zhishi約hi难心デ榭隼吹髡萰iang时jian。

  4.和传统deTRIZOL提取RNAde方fa一样,将匀jiang样品在室蝜u胖眉阜种樱购怂岬鞍譮u合物完全分li。

  5.每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿,剧烈振荡ruo干秒,室蝜u胖眉阜种印Ⅻbr style="margin: 0px; padding: 0px;" />
  6.2-8℃10000×gli心十几分钟。样品分为san层:底层为huang色有机相,上层为wu色水相和一ge中jian层。

  7.把水相转yi到新管中,如要分liDNA和蛋白质可保留有机相,进一步操作见后。用yi丙醇沉淀水相中deRNA。每使用1ml TRIzol加入yi丙醇,室蝜u胖眉阜种印Ⅻbr style="margin: 0px; padding: 0px;" />
  8.2-8℃10000×gli心10分钟,li心前看不出RNA沉淀,li心后在管侧和管底出现胶状沉淀。yi去上qing。

  9.用75℅乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。2-8℃不超过7500×gli心几分钟,qi上qing。

  10.室蝜u胖酶稍锘蛘婵zhan楦蒖NA沉淀,da约晾5-10分钟即可.不要真kongli心干燥,过于干燥hui导致RNAde溶解性dadajiang低。加入wuRNasede水,用枪tou吸打糵u?55-60℃放置10分钟使RNA溶解.如RNA用于酶切fan应,勿使用SDS溶液。

  常见问题分析:

  1得聅hi停裹/strong>

  A.样品lie解或匀jiangchu理不彻底

  B.RNA沉淀未完全溶解

  C.检测吸guang度时,RNA样品胔ui腥苡谒苡诹薚E中。低li子浓度和低pHzhi条件xiaA280zhi偏高

  D.样品匀jiang时加de试剂量太少

  E.匀jiang样品时未在室蝜u胖眉阜种尹br style="margin: 0px; padding: 0px;" />
  F.吸取水相时混入了有机相

  2 RNAjiang解

  A.组zhi取出后胔ui新砩蟘hu理或冷dong

  B.待提取RNAde样品胔ui斜4嬗?60至-70℃,而保存在了-5至-20℃

  C.xi胞在用胰酶chu理时过度

  D.溶液或li心管未经RNase去除chu理

  E.电泳时使用de甲quanpHzhi低于了3.5

  3 DNA污ran:

  A.样品匀jiang时加de试剂量太少

  B.样品中含有有机溶剂(如乙醇,DMSO等),强huan冲液或碱性溶液

  yu防RNase污ran注yi事项:

  1.经常更huan衛v痔祝u上常带有dexi菌,霉菌可neng成为RNasede来源。

  2.使用灭过菌deRNA专用塑料制品避mianjiao叉污ran。

  3.RNA在TRIzol试剂中时瞙uan岜籖Nase污ran,但提取后继续chu理过程中应使用瞙uan琑Nasede塑料和bo璃器皿。

  4.pei制溶液应使用wuRNasede水

  本shi验已经研磨de各ge组zhi中发现肝zang组zhi是最容易研磨,研磨效lv是最好de。

  xiatuA是RNA经过传统de液氮研磨和匀jiang器研磨fa抽出deRNApao胶tu,结果很明显发现这謟hi絝a是可行de,是可yi代替传统de方fade。

 


  xiatuB是利用组zhi匀jiang器对小鼠de各ge组zhi进行匀jiang抽出deRNApao胶tu。发现在抽提各ge组zhideRNAde时候也是可行de。
 


  tuC是利用组zhi匀jiang器对人结肠癌biao本进行了研磨后抽提出deRNAdepao胶tu。
 


  tuD是小鼠de肝zang组zhi经过手gong研磨和机器匀jiang后,最后抽提得礿iang腞NA进行了浓度de测ding,结果说明组zhi匀jiang器抽提出得RNAde浓度要显著高于传统de手gongde方fa得礿iang腞NA。
 


  蛋白謘hi奶崛狘/strong>

  A.genju需要抽提de组zhi样品de质量加入相应de蛋白质lie解液(如RIPA),同时加入3ke不xiu钢zhu。(小鼠肝zang组zhi加入1mlRIPA蛋白lie解液,人结zhi肠癌组zhi加入500ulRIPA蛋白lie解液)

  B.把加入样品,蛋白lie解液,不xiu钢zhudeAxygene EP管放入事先yu冷好de试管座中。机器设置好参shu盖蓌i亲樱慊髟诵小Ⅻbr style="margin: 0px; padding: 0px;" />
  yixia同上RNAde操作方fa

  最终所得礿iang牡鞍字逝ǘ萪e测ding经过BCA试剂盒测ding完成de,同时通过SDS-PAGE后经过考马斯亮蓝ran色和western blot检测都发现其要比传统de方fa更加简便快捷,不容易引起jiao叉污ran。

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